Принцип експеримента
Електрофореза хемоглобина има за циљ да открије и потврди различите нормалне и абнормалне хемоглобине.
Због различитих наелектрисања и изоелектричних тачака различитих типова хемоглобина, у одређеном пХ пуферском раствору, када је изоелектрична тачка хемоглобина нижа од пХ пуферског раствора, хемоглобин носи негативно наелектрисање и мигрира ка аноди током електрофорезе. Насупрот томе, хемоглобин са позитивним набојем креће се ка катоди.
Под одређеним напоном и после одређеног времена електрофорезе, хемоглобини са различитим наелектрисањем и молекуларном тежином показују различите правце и брзине миграције. Ово омогућава одвајање различитих зона, а накнадна колориметријска или електрофоретска анализа скенирања може се извршити на овим зонама да би се квантификовали различити хемоглобини. Најчешће коришћена метода је електрофореза са мембраном целулозног ацетата пХ 8,6.
Унутар цитоплазме, етилен гликол групе (ЦХОХ-ЦХОХ) присутне у гликогену или полисахаридним супстанцама (као што су мукополисахариди, мукопротеини, гликопротеини, гликолипиди, итд.) се оксидују периодичном киселином и претварају у алдехидне групе (ЦХО-ЦХО). Ове алдехидне групе се комбинују са безбојним пурпурно-црвеним Шифовим реагенсом, формирајући љубичасто-црвену боју која се таложи тамо где су полисахариди присутни у ћелији. Ова реакција је позната као бојење периодичном киселином по Шифу (ПАС), раније названо бојење гликогена.
Метод експеримента
Материјали:Целулоза ацетатмембране, апарат за електрофорезу(ДИЦП-38Ц и напајање ДИИ-6Ц), Врхунски алат за учитавање узорка (пипета), спектрофотометар, колориметријске кивете, тампонима.
бафер:
(1) пХ 8,6 ТЕБ пуфер: Измерити 10,29 г Трис, 0,6 г ЕДТА, 3,2 г борне киселине и додати дестиловану воду у 1000 мл.
(2) Боратни пуфер: Одмерити 6,87 г боракса и 5,56 г борне киселине и додати дестиловану воду у 1000 мл.
Процедура:
Pрепарација раствора хемоглобина
Узмите 3 мл крви која садржи хепарин или натријум цитрат као антикоагуланс. Центрифугирајте на 2000 о/мин 10 минута и баците плазму. Исперите црвена крвна зрнца три пута физиолошким раствором (750 о/мин, сваки пут 5 минута центрифугирања). Центрифугирајте на 2200 о/мин 10 минута и баците супернатант. Додајте једнаку количину дестиловане воде, а затим додајте 0,5 пута запремину угљен-тетрахлорида. Снажно протресите 5 минута, а затим центрифугирајте на 2200 о/мин 10 минута да бисте прикупили горњи раствор Хб за каснију употребу.
Натапање мембране
Исеците целулозно ацетатну мембрану на траке димензија 3 цм × 8 цм. Потопите их у пуфер пХ 8,6 ТЕБ док не буду потпуно засићени, затим уклоните и осушите филтер папиром.
Уочавање
Користите пипету да убаците 10 μл раствора хемоглобина вертикално на целулозно ацетатну мембрану (храпава страна), око 1,5 цм од ивице.
Електрофореза
Сипајте раствор боратног пуфера у комору за електрофорезу. Поставите целулозно ацетатну мембрану са мрљавом страном на катодни крај коморе. Радите на 200 В 30 минута.
Елуција
Исеците зоне ХбА и ХбА2, ставите их у одвојене епрувете и додајте 15 мл, односно 3 мл дестиловане воде. Лагано протресите да се хемоглобин потпуно елуира, а затим промешајте.
Колориметрија
Уклоните апсорпцију помоћу дестиловане воде за раствор за елуирање и измерите апсорбанцију на 415 нм.
Калкулација
ХбА2(%) = Апсорбанца ХбА2 епрувете / (Апсорбанца ХбА епрувете × 5 + Апсорбанца ХбА2 епрувете) × 100%
Прорачун експерименталних резултата
Референтни опсег за пХ 8,6 ТЕБ пуфер целулозни ацетат електрофореза: ХбА > 95%, ХбА2 1%-3,1%
Напомене
Време електрофорезе не би требало да буде предуго. Целулоза ацетатна мембрана не би требало да се осуши током електрофорезе. Зауставите електрофорезу када су ХбА и ХбА2 јасно раздвојени. Продужена електрофореза може изазвати дифузију траке и замућење.
Избегавајте коришћење превише узорка. Прекомерна течност хемоглобина може довести до одвајања траке или недовољног бојења, што резултира лажно повишеним нивоима ХбА.
Спречити контаминацију целулозно-ацетатне мембране протеинима.
Струја не би требало да буде превисока; у супротном, хемоглобинске траке се можда неће одвојити.
Увек укључите узорке нормалних појединаца и неопходне познате абнормалне хемоглобине као контроле.
Пекинг Лиуии Биотецхнологи производи професионални резервоар за електрофорезу за електрофорезу хемоглобина који је моделДИЦП-38Црезервоар за електрофорезу са целулозном ацетатном мембраном, а постоје два модела напајања електрофорезе за резервоар за електрофорезу са мембраном од целулозног ацетатаДИИ-2ЦиДИИ-6Цнапајање.
У међувремену, Беијинг Лиуии Биотецхнологи обезбеђује мембрану од целулозног ацетата за купце, а величина целулозно ацетатне мембране може се прилагодити. Добродошли да нас питате за узорке и више информација.
Беијинг Лиуии бренд има више од 50-годишњу историју у Кини и компанија може да обезбеди стабилне и висококвалитетне производе широм света. Кроз године развоја, вредан је вашег избора!
Сада тражимо партнере, и ОЕМ резервоар за електрофорезу и дистрибутери су добродошли.
Ако имате било какав план куповине за наше производе, не устручавајте се да нас контактирате. Можете нам послати поруку на е-маил[е-маил заштићен]или[е-маил заштићен], или нас позовите на +86 15810650221 или додајте Вхатсапп +86 15810650221, или Вецхат: 15810650221
Време поста: 20.09.2023